含白芷方剂组方规律及核心药对“白芷-川芎”分子机制的研究
2019-05-23 15:09:24 浏览：26666 来源：《中国中药杂志》
苏瑾，唐仕欢，郭非非，李德鳯，
张毅，许海玉通讯作者，杨洪军
（中国中医科学院 中药研究所，北京 100700）
中药白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica (Fisch. exHoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，辛、温，归胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、消肿排脓的功效，中医常用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、牙痛、带下、疮痈肿痛等症治疗。现临床常与不同的中药配伍用于治疗皮肤病、头痛、消化性溃疡等多种疾病。
在中医的临床应用中，常将白芷与其他中药配伍使用，来发挥治疗作用。但中药配伍后化学成分的复杂程度远远大于单味药的，因此如何从分子机制层面深入研究中药配伍治疗疾病是中医药领域的热点。整合药理学认为应该兼顾宏观与微观、整体与局部，系统的对中药与机体之间的交互关系进行研究，促进组合药物的研究发展。整合药理学平台是以中医药大数据为基础，使用多种科学计算分析方法和技术所建立的平台，可以快速便捷的构建出“中药方剂-化学成分-作用靶标-疾病靶标”相互关系网络，是一个分析中药方剂的分子机制的高效工具。
本文借助中医传承辅助平台2.5的《中医方剂大辞典》结构化数据库，运用数据挖掘的方法分析白芷在《中医方剂大辞典》中的组方规律，旨在发现含白芷方剂中的核心组合，并通过整合药理学平台（www.tcmip.cn）深入研究白芷核心组合协同分子机制，对白芷临床配伍用药及其分子机制研究提供帮助。
1 数据与方法
1.1数据来源
1.1.1方剂来源 本文对《中医方剂大辞典》中含有白芷的方剂进行收集整理，以“白芷”作为检索关键词（“禹白芷”、“杭白芷”等均作为药物白芷纳入检索结果），共得到3 887个方剂。
1.1.2化学成分来源 在整合药理学平台信息设定页面，检索中药材“白芷”、“川芎”，选择检索出的所有的化学成分，建立“白芷-川芎”化学成分库。
1.1.3候选靶标来源 在整合药理学平台的信息设定界面靶标检索页面，以“headache（头痛）”、“migraine（偏头痛）”作为疾病或症状关键词进行检索，勾选检索出来的所有靶标，作为候选的疾病靶标。在中药靶标预测界面对所建立的“白芷-川芎”化学成分库中的成分进行靶标预测，选取相似性分数＞0.7的成分预测靶标作为候选。
1.2数据分析
1.2.1白芷用药规律分析 本文使用中医传承辅助平台中集成规则分析、互信息法等数据挖掘方法，对本课题组前期建立的《中医方剂大辞典》数据库中含白芷的方剂进行药物频次分析、组方规律分析（聚类分析、提取组合、网络化展示等）等分析。对含白芷方剂治疗频率最高的疾病，进行深入分析，明确白芷治疗头痛的核心组合。
1.2.2核心组合对分子机制研究 应用整合药理学平台靶标预测、网络构建等功能，进行分析及可视化工作。构建“白芷-川芎”成分-靶标网络，及“白芷-川芎”-头痛及偏头痛相关靶标网络，并对“白芷-川芎”所作用的头痛及偏头痛相关靶标进行功能分析及通路分析。
2 结果
2.1含白芷方剂组合规律分析
2.1.1含白芷方剂疾病分析 检索结果显示，《中医方剂大辞典》中含有“白芷”的方剂有3 887首，涉及1 616种主治疾病，其中使用频率较高（＞30）的有15种疾病。多数由风邪引起的头痛、中风、痹症、感冒等，另包含大部分皮肤疾病如痈疽、中风、疮疡等（表1）。
2.1.2含白芷方剂常用药物频次分析 在3 887首方剂中，共涉及2 534味中药，使用频次较高（＞500）的共有17味中药（表2）。结果显示，白芷经常与川芎、当归、防风等活血祛风药配伍使用，这与上述分析中白芷用于治疗头痛、中风、痹症等中医疾病结果一致。
2.1.3含白芷方剂用药高频核心组合分析 在2.1.2项下基础上用关联规则挖掘方法，将支持度设置为20%（即该数据出现的频次至少占处方数的20%），得到常用核心药物组合16个，其中2味药组合11个，3味药组合5个（表3，图1）。
2.1.4白芷在头痛方剂中的用药规律分析 经过上述分析发现白芷在治疗头痛上应用较为广泛，因此进一步对治疗头痛的含白芷方剂进行深入分析。在含白芷方剂中筛选“中医疾病”项明确记载治疗头痛的方剂，筛选出77个方剂共涉及药物176味，通过频次统计得出，含白芷方剂在治疗头痛时使用频率较高（＞20）的有8味（表4）。再基于关联规则挖掘方法对治疗头痛的白芷方剂进行分析，在支持度为30%时，对核心药物模式进行分析，结果显示，治疗头痛的核心组合中使用频率最高的为白芷-川芎（表5）。
2.2“白芷-川芎”核心组合对应用规律分析
通过上述分析，可以发现白芷的核心药物组合。本研究选取具有代表性的药物进行进一步分析，深入挖掘白芷用药配伍规律。在前期分析中发现在含白芷方剂中配伍使用频率最高的药材是川芎。在支持度为25%时，核心药物组合比较明晰（图2）。川芎具活血行气，祛风止痛之功效，临床常用于治疗胸痛、跌打肿痛、头痛等多种疾病。白芷与同为祛风之品的川芎配伍使用，可加强其祛除风邪的功效，是治疗头痛、中风的佳选。这与前文对于含白芷方剂的疾病分析结果是一致的。此外在对含白芷方剂治疗头痛的用药规律进行分析，发现其治疗头痛的常用核心组合依然是“白芷-川芎”（表5），又对含“白芷-川芎”方剂治疗头痛常用药物组合网络进行分析（图3）。在我国中医常将偏头痛归于头痛。白芷-川芎应用于头痛治疗由来已久。《本草求真》记载“白芷……能治阳明一切头面诸疾，如头目昏痛……”。《神农本草经》中关于川芎有“主中风入脑头痛”的描述。《本草经集注》中关于川芎的描述中更有“白芷为之使”的说法。“白芷-川芎”配伍使用在我国历代方剂医案中均有记载，《仁斋直指》卷二十一中的芷芎散主治头痛，《古今医鉴》卷九中白芷、川芎两味药组成的芎芷散可治“远年近日偏正头风，疼痛难忍，诸药不效者”。明清《太医院秘藏膏丹丸散方剂》乌头芎芷散现临床常用于治疗各种原因引起的顽固性偏正头风三叉神经痛等症。《太平惠民和剂局方》中川芎茶调散已被制备成中成药，用于风邪头痛的治疗。现在的中医临床治疗中也常应用含有“白芷-川芎”的组方治疗头痛，且均有不错的疗效。
2.3“白芷-川芎”核心组合对分子机制探讨研究
2.3.1核心组合对预测靶标及共性靶标分析 白芷共收集化学成分54个，主要化学成分为香豆素类如欧前胡素、异欧前胡素、白当归素等以及挥发油类如壬基环丙烷、α-蒎烯、1-十四烷醇等；川芎共收集化学成分73个中主要成分为挥发油类如洋川芎内酯等；生物碱类如川芎嗪等；酚类如川芎酚、大黄酚等及有机酸如阿魏酸、咖啡酸等。
通过与FDA批准的药物进行化学结构相似性比对，其中相似性打分＞0.7的药物对应的靶标可能为中药成分潜在的作用靶标，白芷的54个化学成分共预测出671个靶标，川芎的73个化学成分共预测出243个靶标，这些靶标中有91个靶标为白芷和川芎共有的。
2.3.2 “白芷-川芎”核心组合对治疗头痛的核心靶标网络分析 通过整合药理学平台网络分析模块，基于PPI相互作用数据库，构建核心组合对作用的潜在靶标与疾病靶标之间相互作用网络。首先，“度（degree）”大于中位数的节点为“hub”节点，在此基础上，进一步计算3个拓扑结构特征值（degree，node-betweenness，closeness），3个拓扑结构特征值均大于中位数的节点为关键靶标网络，根据条件筛选出关键靶标375个，根据度（degree）值大小排序，显示度（degree）大的前100个靶点，图中节点的大小与degree正相关，其中核心组合化学成分直接作用节点78个，疾病靶点7个（图4）。从图上可以看出，“白芷-川芎”化学成分对头痛、偏头痛的干预虽无直接作用的疾病靶点，但7个疾病靶点HTR2C，HTR2B，HTR1B，HTR1A，HTR1D，HTR1F，HRH4与多个药物靶点相关联，推测“白芷-川芎”可间接作用于疾病相关靶标，从而通过调节患者5-羟色胺水平来干预头痛和偏头痛。药物靶标中还存在与神经炎症关系密切的PDEs家族靶标，如PDE4C、PDE4D等，推测“白芷-川芎”对头痛的干预或也与其干预炎症反应有关。此外，“白芷-川芎”药物靶标还可作用于COX7C，COX5A等与细胞色素C相关的靶点，已有研究报道偏头痛患者细胞色素C活性缺失。“白芷-川芎”药物靶标还包括多个与ATP相关的靶点，如ATP1A1，ATP5A1等，而偏头痛患者的脑部及骨骼肌的ATP水平均异于常人。
2.3.3关键靶标网络基因功能分析和代谢通路分析 通过GO和KEGG数据库对375个关键靶标进行基因和功能分析，结果发现基因功能涉及细胞质基质、线粒体、线粒体基质、线粒体内膜、ATP结合、髓鞘等多个条目。根据P-value值仅显示前10个条目（表6）。靶标通路富集结果显示其主要集中在嘌呤代谢purine metabolism、丙酮酸代谢pyruvate metabolism、脂肪酸降解fatty acid degradation、碳代谢carbon metabolism、糖异生glycolysis /gluconeogenesis等信号通路（表7）。
白芷-川芎药物靶标-疾病靶标进行基因功能分析结果中，有多个聚集于线粒体、ATP、辅酶Q等机体能量相关的条目，在通路分析中同样发现多个通路与人体内能量代谢密切相关，如丙酮酸代谢、脂肪酸代谢、糖异生、氧化磷酸化等，推测头痛或偏头痛与人体能量代谢有着较大关联。查阅文献发现已有研究表明偏头痛与能量代谢有着密切的关系。线粒体损伤与糖异生有关并且会影响头痛的程度。偏头痛与ATP水解有着密切的关系，并且细胞质中与能量密切相关的Ca2+，Mg2+的变化同样会影响到头痛的程度。另有研究发现偏头痛患者体内丙酮酸水平与正常人有差异，嘌呤则参与头痛传递并能导致痛觉超敏。亦有文献研究发现偏头痛与雌激素受体有着一定的关联。
2.3.4 “白芷-川芎”核心组合的“关键成分-核心靶标-关键通路”分析 根据P-value显示前30个关键通路，这些通路涉及多个方面，如能量代谢、嘧啶代谢、氨基酸代谢、核苷酸等以及阿尔兹海默症、帕金森等疾病相关通路。这些通路相关的核心靶标共计137个，与37个“白芷-川芎”化学成分相关联，其中白芷成分15个，川芎成分22个，1个化学成分为二者共有。网络图中“白芷-川芎”化学成分对于头痛的干预主要集中在能量代谢相关通路的靶标上，如东莨菪苷、茵芋苷可作用于的GCK与糖类代谢及糖异生息息相关，可能受川芎三萜、川芎萘呋内酯调节的CAT参与丙酮酸代谢、脂肪酸降解、糖代谢、氨基酸代谢等过程（图5）。查阅相关文献发现，目前白芷、川芎对于头痛干预机制研究多集中于炎症方面，有关能量代谢方面的研究较少。但已有大量研究表明头痛与能量代谢关联密切。白芷川芎的现代药理研究均发现，其多种有效成分具有镇静止痛消炎的作用，尤其川芎可直接作用于中枢神经，此外还发现川芎可通过HTR1B调节血管和神经系统以及多个炎症靶标，减轻头痛。另有研究表明川芎嗪可非抑制竞争于鼠背根神经元ATP激活电流，亦作用于腺嘌呤核苷酸门控性离子通道受体，从而发挥止痛的作用。
3讨论
中药成分复杂，配伍灵活，难以全面描述其与人体的作用规律，这是制约中药现代化研究发展的重要因素。中医传承辅助平台能系统有效的获取中药配伍规律信息，整合药理学平台则能明确方剂药效物质基础及其治疗疾病的分子机制。这两个平台联用既可从宏观角度上了解中药在中医理论指导下的运用规律，又可从微观角度获取其潜在的分子机制；能充分在中医理论所要求的整体层面上对方剂与机体的交互作用进行分析，而又不与现代医学“基因-疾病-药物”研究模式相脱离。
本研究借助中医传承辅助平台，分析白芷方剂组合规律及疾病治疗等，发现白芷在治疗头痛方面应用广泛。而其核心配伍“白芷-川芎”在治疗头痛方面应用较多。又借助整合药理学平台对“白芷-川芎”干预头痛的分子机制关联进行深入分析，其可作用于炎症及能量代谢相关的靶标，通路富集结果也大多为能量代谢相关通路。这对白芷后续研究及中医药的研究提供了一个简洁的思路与方法。
白芷川芎治疗头痛方面虽有诸多报道，但其具体机制仍未十分清晰。本文分析结果中“白芷-川芎”在头痛治疗方面即可以作用于炎症相关的靶标，又与多个能量代谢通路相关，这与现有的有关头痛的文献报道一致，或许是“白芷-川芎”治疗头痛的分子机制。但本研究仅是基于现有研究结果的一个预测，具体的机制还需要具体的实验进行验证，望本研究能为白芷的进一步研究提供参考。