结核分枝杆菌耐药性检测方法的研究进展

基金项目：军队医学科技“十二五”重点项目（BWS11J050）

作者单位：100091 北京，解放军总医院第八医学中心全军结核病研究所 全军结核病防治重点实验室 结核病诊疗新技术北京市重点实验室

通信作者：吴雪琼

【摘要】结核分枝杆菌耐药基因的检测是结核病诊断和治疗中的难题之一，近年来已有多种方法用来检测耐药基因，笔者从在我国获得注册证书的试剂盒，在国际上获得注册证书尚未进入我国的试剂盒和临床前研究的新方法3个方面概述了结核分枝杆菌耐药性检测方法的研究进展。

【关键词】分枝杆菌，结核；抗药性，细菌；诊断技术和方法；综述文献(主题)

耐药结核病，尤其是耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）和广泛耐药结核病（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的诊断和治疗是当前结核病防控面临的重大难题。随着分子生物学理论和技术的发展，结核分枝杆菌（MTB）耐药分子机制逐步被阐明，建立于MTB耐药相关靶基因突变检测基础上的分子药物敏感性检测（drug susceptibility test，DST）试剂盒也逐步问世，目前已能够为临床检测下列靶基因突变：利福平（RFP）耐药相关基因rpoB，异烟肼（INH）耐药相关基因katG和inhA，链霉素（Sm）耐药相关基因rpsl和rrs，乙胺丁醇（EMB）耐药相关基因embB，氟喹诺酮类（FQ）药物耐药相关基因gyrA和gyrB，二线注射类抗结核药物耐药相关基因rrs，吡嗪酰胺（PZA）耐药相关基因pncA。笔者对MTB的DST产品及新方法的研究进展进行概述。

一、获得我国注册证书的试剂盒

截至目前，经我国国家食品药品监督管理总局批准的国内外DST试剂有16个，其中进口试剂有5个，用于表型DST的有3个（BACTEC MGIT 960系统、Bact/ALERT 3D和分枝杆菌药物敏感性检测板Sensititre MYCOTB），用于分子DST的有2个（GeneXpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus）；国产试剂有11个，用于表型DST的有2个［分枝杆菌药物敏感性检测试剂盒（培养法）和MTB药物敏感性试剂盒），用于分子DST的有9个（包括DNA微阵列芯片法、PCR-线性探针杂交法、荧光PCR熔解曲线法和PCR-基因测序法等），用于检测RFP、INH、Sm、EMB和FQ等耐药性。

（一）表型DST方法

1. BACTEC MGIT 960系统：于1997年由美国推出的集分枝杆菌快速生长培养、检测及DST技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。该仪器采用荧光法的原理，在培养管底部包埋有荧光显示剂，直接感应培养管内氧气浓度。当培养管内有分枝杆菌生长时，氧气被消耗，荧光显示剂在二极管的激发下发出荧光，荧光强度记忆探测器每隔60 min连续测定培养管内荧光强度，并通过数据处理得出阳性结果。阳性培养管取出后离心，沉淀物进行涂片抗酸染色以确定是否为分枝杆菌。涂片阳性管进一步进行表型液体DST比例法：每株MTB准备5支MGIT 960培养管，1管为生长对照管，加1∶100无菌生理盐水稀释的菌悬液0.5 ml；4管为加药管，分别加入RFP、INH、Sm和EMB及菌悬液。放入BACTEC MGIT 960仪器，在4～13 d内根据生长指数自动报告耐药或敏感结果。国内研究显示，BACTEC MGIT 960检测与改良罗氏（L-J）培养基比例法比较，检测RFP、INH、Sm和EMB的耐药结果符合率分别为91.62%～98.78%、97.55%～97.77%、93.86%～96.73%和94.97%～96.73%，具有很高的符合率（总符合率为94.55%～97.45%）；但BACTEC MGIT 960检测的平均时间只需6.7～8 d，明显短于改良罗氏（L-J）培养基比例法（平均时间26～42 d）。由上可知，两种方法DST结果具有极高的可比性和高度的一致性，两种方法在培养时间和DST时间上却存在很大差异。虽然BACTEC MGIT 960大大缩短培养和DST时间，但是其试剂价格昂贵，现在国内实验室基本是先用BACTEC MGIT 960进行培养，然后用改良罗氏培养基进行DST。

2. Bact/ALERT 3D：于1996年经美国食品药品监督管理局批准，用于医院及科研机构的细菌培养和鉴定的液体培养系统，是全自动非放射性的快速细菌培养系统。该仪器应用细菌在生长过程中产生二氧化碳的原理，通过比色计传感器和反射光连续自动监测培养瓶底部的二氧化碳变色指示剂的颜色变化，来显示培养瓶内是否有细菌生长。当瓶内有分枝杆菌生长时，产生的二氧化碳渗透至感应器，仪器可自动连续检测，并自动显示有无分枝杆菌生长。当3D系统显示阳性时，按系统操作步骤提示：取出阳性瓶进行涂片抗酸染色，确认有抗酸杆菌后即进行药物敏感性试验（简称“药敏试验”）。取原始分离瓶菌液，接种于预先配制好含有药敏试验所需标准药物浓度的MB/BacT培养基和空白对照（药敏试验菌液需稀释100倍）MB/BacT培养基中，置3D仪器内进行培养与监测，根据分枝杆菌生长的情况对比判断对该药物的敏感性。42 d未见阳性者可报告阴性结果。整个检测过程自动化程度高，操作简便，并在一定程度上能消除实验过程中人为因素导致的偏差。BacT/ALERT 3D法与改良罗氏培养基比例法（L-J比例法）比较，检测RFP、INH、Sm和EMB耐药性的符合率分别为92.00%～96.38%、95.43%～96.38%、78.00%～96.38%和95.43%～100.00%，具有很高的符合率（总符合率为96.38%～100.00%）；但BacT/ALERT 3D法的平均检测时间只需8.5～11.8 d，明显短于L-J比例法（平均检测时间为28.0～42.0 d）。

3. 分枝杆菌药敏检测板Sensititre MYCOTB：美国赛默飞世尔科技有限公司（Thermo Scientific）基于微量肉汤稀释法原理开发的分枝杆菌药敏检测板Sensititre MYCOTB，可检测12种一线和二线抗结核药物［包括RFP、Rfb、INH、EMB、Sm、氧氟沙星（Ofx）、莫西沙星（Mfx）、阿米卡星（Am）、对氨基水杨酸（PAS）、乙硫异烟胺（Eto）、卡那霉素（Km）、环丝氨酸（Cs）］的耐药性，只需10 d。其优点是可获得抗结核药物的最低抑菌浓度（MIC），为临床提供更确切的耐药信息；缺点是实际应用中某些药物的MIC值不好判读。

4. 分枝杆菌药敏检测试剂盒（培养法）：国内基于在液体培养基中进行微孔板DST（比例法）方法开发了多个产品，已获得我国注册证书，如珠海市银科医学工程股份有限公司研发的分枝杆菌药敏检测试剂盒（培养法）可检测16种抗结核药物［Sm、INH、RFP、EMB、利福喷丁（Rpt）、左氧氟沙星（Lfx）、Am、Cm、丙硫异烟胺（Pto）、对氨基水杨酸异烟肼（Pa）、Mfx、PAS、克拉霉素（Clr）、利福布汀（Rfb）、Km和氯法齐明（Cfz）］。郑州安图生物工程股份有限公司生产的MTB药敏试剂盒，用于检测MTB对临床常用的14种抗结核药物的敏感性。包括14种一、二线抗结核药物，主要通过氧化还原指示剂颜色变化显示MTB是否生长，当指示剂由其氧化状态的蓝色转变为还原状态的粉色时，证明MTB的生长，从而判定菌株耐药性，该法以颜色变化增加了视觉观察判断结果的敏感性。

（二）分子生物学检测方法

1. Xpert MTB/RIF：MTB的rpoB基因和突变检测试剂盒（实时荧光PCR法；商品名：Xpert MTB/RIF，以半巢式PCR技术为基础，针对rpoB基因81 bp的RFP核心区域设计了5个相互重叠的分子探针，以检测MTB是否对RFP耐药，另一探针以球芽孢杆菌为内对照，以判断DNA扩增和检测效率。该方法是全球唯一的一套将PCR检测所需的样品准备、DNA扩增和检测3个步骤集于一体，在反应盒中自动化完成的PCR检测系统。考虑到大多数对RFP耐药的MTB同时也对INH耐药，因此，在一定程度上可以通过Xpert MTB/RIF检测出的RFP耐药结果来判断MTB也可能是MDR-MTB，Xpert MTB/RIF检测方法可以作为MDR-TB的一种初步筛查技术。以比例法药敏试验检测结果为参照标准，Xpert MTB/RIF检测MTB对RFP耐药的敏感度为86.80%～97.73%，特异度为95.30%～97.95%。

2. GenoType MTBDRplus：为德国Hain Lifescience公司开发的应用PCR-线性杂交酶显色法检测MTB及其耐药基因的试剂盒。该方法的原理是MTB临床分离株通过多重PCR扩增后，与预先固定在试纸条上的特异性探针反向杂交，通过检测rpoB基因突变确定MTB对RFP的耐药性，通过检测katG和inhA基因确定MTB对INH的耐药性。因此，该方法可以根据rpoB、katG和inhA基因检测结果快速诊断患者是否为MDR-TB，只需要1～2 d的时间。GenoType MTBDRplus与改良罗氏（L-J）培养基比例法比较，检测MTB对RFP耐药性的敏感度和特异度分别为96.55%～100.00%和97.30%～100.00%，两种方法的符合率为96.00%～99.31%；检测MTB对INH耐药性的敏感度和特异度分别为84.44%～92.00%和94.93%～100.00%，符合率为92.25%～96.00%；检测MTB耐多药的敏感度和特异度分别为84.81%～97.00%和81.48%～100.00%，符合率为90.70%～96.00%。

3. MTB耐药基因检测试剂盒（DNA微阵列芯片法）：由解放军第三O九医院全军结核病研究所研发、北京博奥生物有限公司注册生产，通过检测2种一线抗结核药物RFP和INH的3个耐药基因rpoB、katG和inhA启动子来进行耐药结核病的诊断。约95%的MTB菌株对RFP耐药由rpoB基因突变所致。MTB的rpoB基因突变一般发生在一个高度保守的81 bp（第507～533位27个氨基酸密码子）组成的区域内。约60%～80%的MTB菌株对INH耐药由katG及inhA基因突变所致。根据这3个耐药基因的特异性保守核酸序列，运用不对称PCR技术设计末端标记有荧光分子的引物及寡核苷酸探针，PCR扩增后带有荧光分子的DNA片段与芯片上的探针在一定条件下进行杂交反应，根据碱基互补配对原则，PCR扩增产物与探针形成稳定的二级结构，通过芯片扫描仪扫描杂交后的芯片上特定位置的荧光信号，从而检测出样品的耐药基因信息。其中，RFP耐药相关基因rpoB基因检测6个位点13种突变基因型。INH耐药相关基因katG基因及inhA基因启动子各检测1个位点共3个突变基因型。该检测方法可在获得DNA后6 h内得到结果。以传统MTB药敏试验L-J比例法作为参照标准，DNA微阵列芯片法检测MTB对RFP耐药的敏感度为83.30%～92.73%，特异度为98.19%～100.00%，与L-J比例法或绝对浓度法的一致率为91.25%～99.40%；检测MTB对INH耐药的敏感度为72.00%～87.50%，特异度为93.43%～100.00%，与传统药敏试验的一致率为82.50%～98.80%；检测MTB耐多药的敏感度为82.35%～100.00%，特异度为97.30%～100.00%，与传统药敏试验的一致率为96.38%～100.00%。

4. 结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）：由厦门致善生物科技股份有限公司注册生产。该试剂盒应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对RFP耐药突变，通过在MTB包含rpoB基因81 bp的RFP耐药决定区设计引物和探针，4条探针两两分布在不同的反应管内，分别标记不同荧光物质，4条探针完全覆盖rpoB决定区的所有8l bp碱基，且相邻探针末端有2～3个碱基的重叠，从而保证了所有位置的突变均可检测。每个标本有2个反应管，每种突变检测羧基荧光素（FAM）和四氯荧光素（TET）两个通道荧光信号，即每个标本有4个通道的检测结果。利用rpoB探针与rpoB基因PCR扩增的产物结合力的不同会导致熔解温度(Tm)值的差异，标本的熔点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过1 ℃）时判定为野生型；4个通道任一通道中标本的熔点低于阳性对照2℃及以上时判定为突变型，根据熔解曲线的Tm值变化就可判断突变的有无，实现对野生型与突变型的检测。以传统药敏试验L-J比例法或绝对浓度法或BACTEC MGIT 960液体药敏试验为参照标准，荧光PCR熔解曲线检测MTB对RFP的敏感度为90.00%～95.83%，特异度为93.90%～97.42%，符合率为93.00%～99.00%。

5. 结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）：由厦门致善生物科技股份有限公司注册生产。该试剂盒应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对INH耐药突变，在MTB的INH靶基因的扩增阶段设计了5条分别标记不同荧光物质的探针，其中A管3条探针覆盖ahpC启动子区-44～-30位点、inhA94密码子突变和-15～-3位点；B管的2条探针主要检测inhA启动子区-17～-8位点和katG315密码子突变。每个标本有2个反应管，每种突变检测FAM和TET两个通道荧光信号，即每个标本有4个通道的检测结果。标本的熔点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过1 ℃）时判定为野生型；4个通道任一通道中标本的熔点低于阳性对照2 ℃及以上时判定为突变型。根据熔解曲线的Tm值变化就可判断突变的有无，实现对野生型与突变型的检测。以传统药敏试验（L-J比例法）或绝对浓度法或BACTEC MGIT 960液体药敏试验为参照标准，应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对INH耐药的敏感度为80.00%～87.69%，特异度为94.59%～96.40%，符合率为90.70%～97.00%。

6. 结核分枝杆菌链霉素耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）：由厦门致善生物科技股份有限公司注册生产，应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对Sm耐药突变。MTB对Sm耐药的产生是由于核糖体蛋白S12编码基因（rpsL）和16S核糖体RNA编码基因（rrs）突变所致，70%以上的基因突变发生在rpsL43位点。本试剂盒针对rpsL43、rpsL88、rrs513～517和rrs905～908等4个区域进行检测，可以检测到在这4个区域发生突变的全部菌株。检测时每个标本有两管在双色实时PCR仪器进行。一管检测rpsL43、rpsL88密码子基因突变，另一管检测rrs513～517位点和rrs905～908位点基因突变，每种突变检测FAM和TET两个通道荧光信号，即每个标本有4个通道的检测结果。当标本的熔点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过1 ℃）时判定为野生型；4个通道任一通道中标本的熔点低于阳性对照2 ℃及以上时判定为突变型。根据熔解曲线的Tm值变化就可判断突变的有无，实现对野生型与突变型的检测。与L-J比例法为参照标准，应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对Sm耐药的敏感度为78.60%～88.46%，特异度为80.95%～97.35%，符合率为81.82%～94.42%。

7. 结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）：由厦门致善生物科技股份有限公司注册生产，应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对EMB耐药突变。检测分两管在双色实时PCR仪器进行，每个标本有2个反应管，一管检测embB306和embB497位点基因突变，另一管检测embB378～380和embB406位点基因突变，每种突变检测FAM和TET两个通道荧光信号，每个标本有4个通道的检测结果，完成4个常见突变位点上所有突变类型的检测。当标本的熔点与阳性对照的熔点均一致（误差不超过1 ℃）时判定为野生型；4个通道任一通道中标本的熔点低于阳性对照2 ℃及以上时判定为突变型。根据熔解曲线的Tm值变化就可判断突变的有无。以L-J比例法为参照标准，应用荧光PCR熔解曲线法检测MTB对EMB耐药的敏感度为81.97%～88.64%，特异度为75.76%～96.66%，符合率为80.91%～94.17%。

8. 结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药突变检测试剂盒（荧光PCR熔解曲线法）：由厦门致善生物科技股份有限公司注册生产。该试剂盒基于探针熔解曲线分析的原理，以gyrA为靶基因序列进行PCR扩增，扩增体系内含有FAM标记的gyrA基因88～99位核苷酸密码子的荧光探针。在PCR扩增中产生大量靶基因序列，靶序列与探针杂交，杂交产物产生特定的熔点，通过靶序列熔点的变化，判断MTB菌株对FQ药物的耐药情况。由于MTB的gyrB基因的突变率非常低，本试剂盒没有涉及。以7H10琼脂培养基比例法或Middlebrook 7H9液体培养基比例法为参照标准，荧光PCR熔解曲线法检测MTB对FQ药物耐药性的敏感度、特异度、符合率分别为96.2%～97.01%、97.6%～99.55%和97.0%～99.21%。

9. 结核分枝杆菌利福平耐药突变基因检测试剂盒（PCR-反向点杂交法）：由亚能生物技术（深圳）有限公司注册生产。反向点杂交技术是Saiki等在1989年发明的，主要用于检测引起细菌耐药的基因突变。PCR-反向点杂交法是近年发展起来的集DNA探针、核酸杂交和酶联显色三大技术于一体的新型基因诊断技术，用已标记的RFP耐药相关rpoB基因的PCR扩增产物与固定在固相膜上未标记的相应寡核苷酸探针杂交的核酸分子杂交的方法检测rpoB基因3个位点6个基因型的突变。以L-J比例法为参照标准，应用该方法检测MTB对RFP耐药的敏感度为79.66%～94.90%，特异度为91.84%～100.00%，符合率为87.26%。

10. 结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变检测试剂盒（PCR-测序法）：由中山大学达安基因股份有限公司注册生产，用于对MTB复合群的分离培养物进行INH耐药突变检测，检测位点包括katG基因的315位点（AGC→ACC）和inhA基因启动子区-15位点（C→T）的突变。

11.结核分枝杆菌利福平耐药突变基因检测试剂盒（PCR-Sanger测序法）：由中山大学达安基因股份有限公司注册生产，可用于检测MTB分离株对RFP耐药的rpoB基因第507～533中具有明确耐药的531（TCG→TTG）、526（CAC→TAC＼CGC）、516（GAC→GTC）位密码子突变。

二、在国际上获得注册证书但尚未进入我国的试剂盒

1. GenoType MTBDRsl：GenoType MTBDRsl技术原理同GenoType MTBDRplus，都是基于PCR-线性探针杂交检测。2009年，德国Hain Lifescience公司推出了二线抗结核药物耐药快速诊断试剂盒GenoType MTBDRsl 1.0版，可同时快速检测EMB、FQ、Am、Km和Cm常见耐药基因型，如可以检测FQ类药物（如Ofx和Lfx）耐药相关基因gyrA、氨基糖苷类抗生素（如Km、Am）耐药相关基因rrs和EMB耐药相关基因embB的突变。穆成等报道GenoType MTBDRsl试剂盒检测MTB对Ofx耐药性的敏感度和特异度分别为83.3%和95.4%，与传统比例法药敏试验结果具有较高的一致性。Barnard等报道，以BACTEC MGIT 960培养药敏试验为参照标准，GenoType MTBDRsl线性探针实验检测MTB对Ofx、Am耐药和XDR-TB的敏感度分别为90.7%、100.0%和92.3%，特异度分别为98.1%、99.4%和99.6%。而2.0版试剂盒除了能检测1.0版的gyrA和rrs基因，还能检测gyrB和eis启动子基因突变；由于EMB耐药基因检测的敏感度低，2.0版试剂盒不包括EMB耐药性检测。2016年5月2.0版试剂盒虽被WHO推荐，但尚未获得我国医疗器械注册证书。

2. Genedrivet Assay：Genedrivet Assay试剂盒可以检测MTB对RFP的耐药性。其以rpoB基因位于81 bp的核心区域设计引物和探针，检测516、526和531位的突变。检测原理是用一种简单的纸基DNA提取方法，结合不对称PCR和专有的杂交探针技术，获得基因型信息。Castan等报道，用已知数量的MTB液体培养物制成的模型样品，Genedrivet Assay检测MTB对RFP耐药性的总敏感度为72.3%（95% CI：59.8%～82.7%）；对于菌量＞1000菌落形成单位（CFU）/ml的样品，检测敏感度为85.7%；而对于菌量＜100 CFU/ml的样品，检测敏感度为65.9%；检测MTB对RFP的耐药性的特异度为100.0%（95% CI：83.2%～100.0%）。对于临床痰液标本用同样的方法处理，显示出与模型数据具有良好的一致性。用Genedrivet Assay 检测涂片样本稀少或涂片阴性的结核病患者的效能与GeneXpert MTB/RIF相当。

3. REBA MTB-Rifa Assay：由韩国注册生产的一种基于反向杂交原理的线性探针实验，其原理是将特定的寡核苷酸探针固定在膜上，并在严格控制的条件下与生物素标记的PCR产物杂交。该方法由8个探针组成，其中5个探针横跨RFP耐药决定区的野生型rpoB序列，它们构成了最常见的特异性突变。Cho等报道，以L-J比例法为参照标准，在492株MTB临床分离株中，REBA MTB-Rifa检测MTB对RFP耐药的敏感度和特异度分别为98.1%（211/215）和100.0%（277/277）；对228例涂阳患者痰标本，REBA MTB-Rifa检测MTB对RFP耐药的敏感度和特异度分别为100.0%（96/96）和100.0%（132/132）。

三、临床前研究的新方法

1. 多重连接依赖式探针扩增技术（multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA）：由荷兰科学家Schouten等于2002年首次报道，是一种高通量、针对待测核酸中的靶序列进行定性、定量的分析。该方法只需20 ng/μl DNA即可通过简单的杂合、连接、PCR扩增及电泳步骤，可在同一反应管中检测多达50个位点的拷贝数变异，具有高通量、高效率、低成本及自动化程度高等优点，在国内主要用于产前诊断、肿瘤和动物疫病等方面的检测。近几年，国外将该技术用于检测结核病，但在国内还未见此方面应用的报道。MLPA技术原理主要包括：样品DNA变性、探针与靶序列的杂交、探针的特异化连接、连接探针的扩增和结果的检测分析。其操作只需要一台基因扩增仪和序列电泳系统，耗时在24 h以内。Santos等报道，以PCR产物直接测序为参照标准，MLPA和Genotype MTBDRplus检测MTB对INH耐药的敏感度分别为92.8%和85.7%，特异度分别为100.0%和97.5%；对RFP耐药的敏感度分别为87.5%和100.0%，特异度分别为100.0%和98.8%，结果表明两种分子检测方法均可用于快速检测耐药结核病，且具有较高的准确性。

2. 多色荧光实时定量PCR（multi-fluorescence quantitative real-time PCR，MF-qRT-PCR)：根据MTB耐药突变数据库报道和测序结果中的耐药突变的关键位置和频率设计用4种荧光标记的10个探针检测rpoB、katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC和rrs基因的突变。以L-J比例法为参照标准，MF-qRT-PCR检测MTB对RFP耐药的敏感度和特异度分别为94.6%和100.0%，检测MTB对INH耐药的敏感度和特异度分别为85.9%和95.3%；以PCR产物直接测序为参照标准，MF-qRT-PCR检测MTB对RFP耐药的敏感度和特异度分别为97.2%和100.0%，检测MTB对INH耐药的敏感度和特异度分别为97.9%和96.4%。

3. PCR-比色法：PCR-酶联寡核苷酸吸附试验（enzyme-linked oligosorbent assay，ELOSA）是一种低成本的基于DNA探针的比色测定方法，用于MTB对RFP耐药性的检测。其根据RFP基因序列设计rpoB引物，rpoB基因片段通过PCR用地高辛标记，将扩增的产物与选择的等位基因特异性杂交，并将其捕获到涂有链霉亲和素的微量滴定板上，通过比色进行检测。所有探针的检测敏感度和特异度均≥96%。

4. 数字PCR：数字PCR可以检测耐药MTB中的异质耐药性。应用双TaqMan-MGB探针检测katG(315)、rpoB(531)、gyrA(94，95)和rrs的野生型和突变型序列，这些基因分别与INH、RFP、FQ和氨基糖苷耐药相关。数字PCR方法能够检出MTB混合物中千分之一含量的耐药菌。相比之下，实时PCR或普通PCR检测的敏感度低，在MTB混合物中需含10%~50%的耐药菌方能检出。

5. 焦磷酸测序：焦磷酸测序技术（pyrosequencing）是1987年由Nyren等发展起来的一项全新的短片段DNA测序技术，可以准确、快速地测定一段较短的DNA片段，其检测精确性可与传统的Sanger双脱氧链终止法相媲美，且操作极为简便。郑瑞娟等报道应用焦磷酸测序技术，测定150株MTB临床分离株rpoB基因81 bp的RFP抗药性决定区（RRDR），分析rpoB基因突变特点，与绝对浓度法的符合率是92.7%，与MIC法的符合率是97.8%。

6. 全基因组测序（WGS）：该方法与现有的分子检测方法相比，可准确地提供更多的信息，识别各种遗传多态性，包括单核苷酸多态性（SNP）、小片段插入和缺失。目前WGS检测MTB对RFP和INH耐药性的分析性能特征较高，检测RFP耐药的敏感度和特异度分别为98%（95%CI：93%～98%）和98%（95%CI：98%～100%）；检测INH耐药的敏感度和特异度分别为97%（95%CI：94%～99%）和93%（95%CI：91%～96%）；检测其他药物（Sm、EMB和PZA）耐药的性能特点差异很大，对FQ耐药的分析性能优于氨基糖苷类和环肽类药物。未来通过采用分散测序、集中分析模型和半自动生物信息学管道，实现基于端到端的结核病诊断系统，这对患者在临床治疗期间可靠地预测药物敏感性具有重要意义，也为耐药结核病患者的临床管理提供了新的方法。

四、结语

MTB耐药性严重影响结核病的治疗，引起耐药的分子机制主要是药物靶基因的改变。尽管现在已经有多种方法用来检测药物的耐药性，但各有局限性，目前快速耐药检测主要是采用分子生物学的方法，但可检测的抗结核药物有限，而表型DST方法虽需较长检测时间，但可了解MTB对较多抗结核药物的耐药性，两类方法相互结合，取长补短，共同应用于临床，指导结核病化疗方案的制定。随着科学技术的发展，相信会不断研发出新的耐药检测技术，推广应用于临床，以解决当前仍存在的问题。